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分流/不分流進樣——《氣相色譜方法及應用》

                             一、進樣口結構
分流/不分流進樣口是毛細管GC更常用的進樣口，它既可用作分流進樣，也可用作不分流進樣口圖4-2是典型的分流/不分流進樣口示意圖。從結構上看，分流/不分流進樣口與填充柱進樣有明顯的不同，一是前者有分流氣出口及其控制裝置，二是除了進樣口前有一個控制閥外，在分流氣路上還有一個柱前壓調節(jié)閥，二是二者使用的襯管結構不同。而分流進樣和不分流進樣在操作參數(shù)的設置，對樣品的要求以及襯管結構方面也有很大區(qū)別，下面分別討論之。

 二、分流進樣
(一)載氣流路和襯管選擇
分流進樣時載氣流路如圖4-2a所示。進入進樣口的載氣總流量由一個總流量閥控制，而后載氣分成兩部分:一是隔墊吹掃氣(1～3mL/min)，二是進入汽化室的載氣。進入汽化室的載氣與樣品氣體混合后又分為兩部分：大部分經(jīng)分流出口放空，小部分進樣色譜柱。以總流量為104 m1/min為例，如果隔墊吹掃氣流設置為3m1/min，則另101mL/min進入汽化室。當分流流量為100mL/min時。柱內(nèi)流量為lml/min，這時分流比為100:1。注意。此儀器設計將柱前壓調節(jié)閥置于分流氣路上，這就可在總流量不變的情況下，改變柱前壓。柱前壓越高，柱流速越大，分析速度越快。而要在柱前壓(柱流速不變)的條件下改變分流比，則必須調節(jié)總流更?？偭髁吭酱?，分流比越大。
分流進樣口可采用多種襯管，用于分流進樣的襯管大都不是直通的，管內(nèi)有縮徑處或者燒結板，或者有玻瑞珠，或者填充有玻璃毛。這主要是為了增大.與樣品接觸的比表面，保證樣品*汽化.減小分流歧視〔見下面關于分流歧視問題的討論)。同時也是為了防止固體顆粒和不揮發(fā)的樣品組分進入色譜柱。注意，填充物應位于襯管的中間，即溫度更高的地方，也是注射器針尖所到達的地方，這樣對提高汽化效率，減少注射器針尖對樣品的歧視更為有效。另外，玻璃毛活性較大，不適合于分析極性化合物。此時可用經(jīng)硅烷化處理的石英玻璃毛。

襯管的上端常用“O"形硅橡膠環(huán)密封。用一段時間后該環(huán)會老化而造成漏氣。故要及時更換。當進樣口溫度超過400℃時，更好采用石墨密封環(huán)。

(二)樣品的適用性
分流進樣適合于大部分可揮發(fā)樣品，包括液體和氣體樣品，特別是對一些化學試劑(如將劑)的分折。因為其中一些組分會在主峰前流出。而且樣品不能稀釋、故分流進樣住往是理想的選擇。此外，在毛細管GC的方法開發(fā)過程中，如果對樣品的組成不很清楚。也應首先采用分流進樣口對于一些相對“臟"的樣品，更應采用分流進樣，因為分流進樣時大部分樣品被放空，只有一小部分樣品進入色譜柱，這在很大程度上防止了柱污染。只是在分流進樣不能滿足分析要求時（靈敏度太低），才考慮其他進樣方式，如不分流進樣和柱上進_樣等。 
總之，分流進樣的適用范圍寬，靈話性很大。分流比可調范圍廣，故成為毛細管GC的進樣方式。
(三)操作參數(shù)設置
1.溫度
進樣口溫度應接近于或等于樣品中更重組分沸的點，以保證樣品快速汽化，減小初始譜帶寬度。但溢度太高有使樣品組分分解的可能性。對于個未知的新樣品?？蓪⑦M樣口溫度設置為300度進行試驗。 
2.載氣流速
常用毛細管GC所用柱內(nèi)載氣線流速為：氦氣30～50cm/s，氮氣20～40cm/s，氫氣40～60cm/s。實際流速可通過測定死時間來計算，通過調節(jié)柱前從來控制。對于分流進樣，還要測定隔墊吹掃氣流量和分流流量，前者一般為2～3mL/min，后者則要依據(jù)樣品情況(如待側組分濃度等)、進樣量大小和分析要求來改變。常用分流比范圍為20:1～200:1，樣品濃度大或進樣量大時，分流比可相應增大，反之則減小。用大口徑柱時分流比小一些(或采用不分流進樣)。用微徑柱作快速GC分析時，分流比要求很大(如1000:1或更高)。另一方面，分流比小時，分流歧視(見下面關于分流歧視問題的討論)效應可能小一些，但初始譜帶(主要是溶劑譜帶)寬度要大一些。必要時可采用聚焦技術。而分流比大時，初始譜帶寬度小，但分流歧視效應可能會增大。所以，在實際工作中應據(jù)樣品情況和分析要求選擇一個合適的折衷點。
3.進樣量和進樣速度
分流進樣的進樣量一般不超過2μL,更好控制在0.5μL以下，因為襯管的容積有限，液體汽化時體積要膨脹數(shù)百倍(見表4-1)。當然。進樣量還和分流比是相關的，分流比大時，進樣量可大一些。至于進樣速度應當越快越好，一是防止不均勻汽化，二是保持窄的初始譜帶寬度。因此，快速自動進樣往往比手動進樣的效果好。

(四)分流歧視問題
所謂分流歧視是指在一定分流比條件下，不同樣品組分的實際分流比是不同的，這就會造成進入色譜柱的樣品組成不同于原來的樣品組成，從而影響定是分析的準確度。因此，采用分流進樣時必須注意這個問題。那么，是什么因素造成分流歧視的呢？

不均勻汽化是分流歧視的上要原因之一，即由于樣品中各組分的極性不同，沸點各異，因而汽化速度各不相同。理論上講，只要汽化溫度足夠高，就能使樣品的全部組分迅速汽化。只要汽化室內(nèi)樣品處于均相氣體狀態(tài)，分流歧視就是可以忽略的。然而，實際上樣品在汽化室是處于一種運動狀態(tài)，即必須隨載氣流動。從汽化室汽化到進入色譜柱的時間很短(以秒計)，沸點不同的組分到達分流點時，汽化狀態(tài)可能不*相同。這樣，由于分流流量遠大于柱內(nèi)流量，汽化不太*的組分就比*汽化的組分可能多分流掉一些樣品。造成分流歧視的另外一個原因是不同樣品組分在載氣中的擴散速度不同。而擴散速度與溫度是成正比的。所以。盡量使樣品快速汽化是消除分流歧視的重要措施，包括采用較高的汽化溫度，也包括使用合適的襯管。 
分流比的大小也會影響分流歧視口一般地講，分流比越大，越有可能造成分流歧視口所以，在樣品濃度和柱容量允許的條件下，分流比小一些有利。至于分流比的測定定是很簡單的，只要在分流出口用皂膜流量計測定分流流量，再測定柱內(nèi)流量(因為柱內(nèi)流量很小，用皂膜流量計測定時誤差較大，故常用測定死時間的辦法進行流量計算)。二者之比即為分流比。嚴格地講，兩個流量值應校正到相同的溫度和壓力條件下，才能獲得準確的分流比。實際工作中人們更關心的是分流比的重現(xiàn)性，分流比則常用整數(shù)之比表示，故一般不需要很準確地測定。
具體分析中要消除分流歧視，還應注意色譜柱的初始溫度盡可能高一些。這樣，汽化溫度和柱箱溫度之差就會小一些，因而樣品在汽化室經(jīng)歷的溫度梯度就會小一些，可避免汽化后的樣品發(fā)生部分冷凝。更后一個問題是色譜柱的安裝，一是要保證柱入口端超過了分流點。二是保證柱入口端處于汽化室襯管的中央，即汽化室內(nèi)色譜柱與襯管是同軸的(參看上一章有關色譜柱安裝的內(nèi)容)。
盡管分流進樣有歧視間題，但它仍然是毛細管GC中更常用的進樣方式。在實際工作中。分流歧視是很難*消除的，但只要操作是重現(xiàn)的，一定程度的歧視是重現(xiàn)的。就可以通過標準樣品的校準來消除歧視效應對定量精度的影響
另一方面。由于分流進樣給檢測靈敏度提出了更高的要求，而當樣品濃度太低時。分流進樣并不總是合適的選擇。除了進行樣品預處理(如濃縮)外。讀者很容易想到不分流進樣。既然分流進樣是因為柱容量小、樣品濃度高而不得不采用的方法。那么低濃度樣品采用不分流進樣，以提高檢測靈敏度就是理所當然的選擇了。

三、不分流進樣
(一) 載氣流路和襯管選擇
不分流進樣與分流進樣采用同一個進樣口，顧名思義，不分流進樣就是將分流氣路的電磁閥關閉[圖4-2(b)]，讓樣品全部進入色潛柱。這樣做的好處是顯而易見的，既可提高分析靈敏度，又能消除分流歧視的影響。然而，在實際工作中、不分流進樣的應用遠沒有分流進樣普遍，只是在分流進樣不能滿足分析要求時(主要是靈敏度要求)，才考慮使用不分流進樣。這是因為不分流進樣的操作條件優(yōu)化較為復雜。對操作技術的要求高。其中一個更突出的問題是樣品初始譜帶較寬(樣品汽化后的體積相對于柱內(nèi)載氣流量太大)。汽化的樣品中溶劑是大量的，不可能瞬間進入色譜柱，結果溶劑峰就會嚴重拖尾，使早流出組分的峰被掩蓋在溶劑拖尾峰中[如圖4-3(a)所示]，從而使分析變得困難，甚至不可能。有人也將這一現(xiàn)象叫做溶劑效應。

消除這種溶劑效應可從幾個方面考慮，但就載氣的流路來說，主要是采用所謂瞬間不分流技術。即進樣開始時關閉分流電磁閥，使系統(tǒng)處于不分流狀態(tài)[圖4-2(b)]。待大部分汽化的樣品進入色醉柱后，開啟分流閥，使系統(tǒng)處于分流狀態(tài)[圖4-2(a)]。這樣，汽化室內(nèi)殘留的溶劑氣體(當然包括一小部分樣品組分)就很快從分流出口放空，從而在很大程度上消除了溶劑拖尾[如圖4-2(b)所示]。分流狀態(tài)一直持續(xù)到分析結束，注射下一個樣品時再關閉分流閥。所以我們說，不分流進樣并不是不分流，而是分流與不分流的結合。這里，確定一個瞬間不分流時間(從進樣到開啟分流閥的時間)往往是分析成敗的關鍵。原則上講，這一時間應足夠長。以保證絕大部分樣品進人色譜柱，避免分流歧視的影響；同時又要盡可能短，以更大限度地消除溶劑搶尾、使早流出峰的分析更為準確。這顯然是有矛盾的。在實際工作中，常常是根據(jù)樣品的具體情況(如溶劑沸點、待測組分沸點和濃度等)或操作條件來確定一個優(yōu)化的折衷點。研究結果表明，這一時間值一般在30～80S之間。文獻報道多采用0.75min，即從進樣到開啟分流閥的時問為0.75min，通常能保證95%以上的樣品進入色譜柱，本節(jié)后而將介紹如何用實驗方法確定優(yōu)化的不分流時間。
襯管的尺寸是影響不分流進樣性能的另一個重要因素。為了使樣品在汽化室盡可能少地稀釋，從而減小初始譜帶寬度，襯管的容積小一些有利，一般為0.25～1mL，且更好使用直通式襯管。當用自動進樣器進樣時，因進樣速度快，樣品揮發(fā)快，故建議采用容積稍大一些的直通式襯管。對于干凈樣品，襯管內(nèi)可不填充玻璃毛，對于相對臟的樣品，則需要填充玻瑞或石英毛，以保證分析的重現(xiàn)性并保護色譜柱不被污染。但要注意，由于不分流進樣時樣品在汽化室滯留的時間比分流進樣時長，熱不穩(wěn)定化合物的分解可能性也大，故襯管和其中填充的石英毛都必須經(jīng)硅烷化處理，且要及時清洗，更換和重新硅烷化。

(二)樣品的適用性
不分流進樣具有明顯高于分流進樣的靈敏度，它通常用于環(huán)境分析(如水和大氣中痕量污染物的檢測)、食品中的農(nóng)藥殘留監(jiān)測，以及臨床和藥物分析等。這些藥品往往都比較臟，所以樣品的預處理是保護色譜柱所必須注意的問題。此外，待測痕量組分如果在溶劑拖尾處出蜂，還可采用溶劑聚焦的方法來提高分析靈敏度。

不分流進樣對樣品溶劑有較嚴格的要求。因為進樣口溫度、色譜柱初始溫度、瞬間不分流的時間和進樣體積都與溶劑沸點有關。一般地講，使用高沸點溶劑比低沸點溶劑有利，因為溶劑沸點高時，容易實現(xiàn)溶劑聚焦，且可使用較高的色譜柱初始溫度，還可降低注射器針尖歧視以及汽化室的壓力突變。表4-2列出了常見的溶劑及其沸點和實現(xiàn)溶劑聚焦宜采用的色譜柱初始溫度。

另一方面，洛劑的極性一定要與樣品的極性相匹配，且要保證溶劑在所有被測樣品組分之前出峰，否則早流出的峰就會被溶劑的大峰掩蓋。同時，溶劑還要與固定相匹配，才能實現(xiàn)有效的溶劑聚焦。必要時可采用保留間隙管來達到聚焦的目的。
對于高沸點痕量組分的分析，不分流進樣就容易多了。此時可以不考慮溶劑的沸點，因為有周定相聚焦就完保證窄的初始譜帶，采用高的初始柱溫還可縮短分析時間。事實上，不分流進樣應是分析高沸點痕更組分的方法。
(三)操作參數(shù)設置
(1)進樣口溫度 進樣口溫度的設置可以比分流進樣時稍低一些，因為不分流進樣時樣品在汽化室滯留時問長，汽化速度稍慢一些不會影響分離結果，還可通過溶劑聚焦和/或固定相聚焦來補償汽化速度慢的問題。不過，進樣口溫度的低限是能保證待測組分在瞬間不分流時*汽化，否則，過低的進樣口溫度會造成高沸點組分的損失，影響分析靈敏度和重現(xiàn)性。當然，過高的溫度又會造成樣品的分解。因此，要根據(jù)樣品的具體情況優(yōu)化進樣口溫度。而當改變進樣口溫度后，又必須重新優(yōu)化設置瞬間不分流時間:.
(2)載氣流速 從減小初始譜帶寬度的角度考慮，不分流進樣的載氣流速應當高一些，其上限應以保證分離度為準。分流出口的流量(開啟分流閥后)一般為30～60mL/min。只要開啟分流閥的時間設置正確，分流出口流更在此范圍內(nèi)變化對分析結果的影響很小。 
(3)進樣量和進樣速度 進樣量一般不超過2μL。進樣量大時應選用容積大的襯管，否則會發(fā)生樣品倒灌。進樣速度則應快一些，更好用自動進樣器。若采用手動進樣，進樣速度的重現(xiàn)性會影響分析結果。
(4)瞬間不分流時間的實驗確定方法 如前文所述，瞬間不分流時間(也有人叫分流延遲時間、溶劑吹掃時間)的確定依賴于樣品和溶劑的性質，襯管的容積、進樣更，進樣速度以及載氣流速。所以這一時問的確定應在其余所有條件都確定之后進行。下面介紹一個簡單的實驗確定方法。
首先將這一時間設置長一些(90～120s)，以保證全部樣品組分進入色譜柱。對樣品進行分析之后，選擇一個待測組分的峰面積(該峰的k值應大于5)作為測定指標，該峰面積值就代表100％的樣品進入
了色譜柱。
然后逐步縮短不分流時間(如70, 50, 30s)分別進樣分析，計算同一組分在不同溶劑吹掃時間條件下的峰面積與*次分析的峰面積之比，直到此比值小于0.95,此時的不分流時間為更短時間。
更后，再進一步微調不分流時，使同一組分的峰面積達到*次分析時峰面積的95%-99％，此時的吹掃時間即為更佳條件。
對于高沸點樣品，不分流時間長一些有利于提高分析靈敏度。而不影響測定準確度；對于低沸點樣品。則要盡可能使不分流時間短一些，更大限度地消除溶劑拖尾，以保證分析準確度。對于熱不穩(wěn)定的化合物，更好用下節(jié)將要介紹的冷柱上進樣技術。